晶体日记 （十二）-寻找“Q”峰背后的原因(5)：无意的无序

奇怪的Q峰

读书时，老师和师兄们总教导我们要把蛋白提纯了再去长晶体。纯度越高越好（>95%），这样晶体才能长得漂亮。于是各种层析柱子的提纯成了日常较多的工作。而且不光是表观上SDS-PAGE的纯度，我们还要求蛋白尽可能状态的均一。甚至在我们的意识里，蛋白是有生命的，越早越快地提纯出来，蛋白才是“活"的。于是各种加班加点的穿着棉袄在冷库里做实验，废寝忘食都不为过。然而到了工作的时候，接触到了化学晶体，却让我对结晶对纯度的要求一度十分的困惑，各种纯度都有进行长晶体的实验。对纯度的要求好像没有那么严格，甚至有时候会故意做一些掺杂，来诱导长晶体。总之，众说纷纭，结晶重新回到了玄学（或者漫不经心）。

我相信很多同学的晶体总是长不好，跟纯度或多或少是有些关系的。不过，目前讨论的内容是关于奇怪的Q峰。概念中，同样的分子按照周期性的排列，从而长成了晶体。这是晶体的理论。然而现实中，少许不同的分子也同样可以生长在一起（这里不是指共晶），形成晶体。这在无机晶体和矿物晶体中，十分的常见，同样的位置有不同元素的原子占据着，名为置换无序。这些“无序"通常是天然存在，或者人为引入的。然而对于有机分子，也存在同样的问题，只是很多时候我们没有意识到，所以懵圈在那里了，不知道发生了什么。甚至即便得到了十分合理的解释，到了很多同学那里也会死不认账，认定一定是解析错了… 实际上在很多同学生长的晶体里，这一点都不是什么罕见的事情。
举例说明

我们先看一下常见的例子。这个结构解析的十分顺利，基本上APEX3的AutoStructure就可以自动地把“原定"的结构解析完毕。然而在苯环附近，有一个很奇怪的Q峰，虽然不大，但是却不能被忽略。我们不能简单认为Q峰小于1了就可以忽略不记了（说实在的，这个“定律"不知从何而来，或者前提条件在传播的过程中被无视了…）。仔细看下这个1.02 的Q峰恰好位于 C2原子正对的地方，距离是可以成键的范围。可以确定的是，这里不会是游离的无序水，也不会是其它可以无序的基团。那会是怎么回事呢？

▲图 1 abnormal Q peak

在查看了衍射图和倒易空间之后，基本可以排除晶体存在非缺面孪晶或者衍射点的其它问题，因为衍射点十分的整齐。同时对于三斜的这个晶体，它也不存在赝缺面孪晶导致的问题。重复测试多颗晶体，这里都存在相同的问题。所以大概率下数据的|Fo|是没有问题的。那么问题就落在了结构模型|Fc|上。仔细研究这个Q峰，我们会得到两个信息，首先它在接近苯环C2正对的位置上，几何构象上看起来特别像是苯环延伸出的原子。另外它与C2原子的距离在1.7 Å左右。如果忽略既有给定的结构式和Q峰的大小，这里特别像是一个Cl的取代基。假定这里是Cl原子，放开占有率精修，我们会得到该位置Cl的占有率只有4%。

▲图2 possible disorder

所以我们的推断是，这里实际上是另一种Cl取代基的分子在这里的混合无序。而较有可能的原因是用于结晶的原料不够纯，可能是反应的中间产物或者是副产物。虽然比例不高，但已然掺入到了结晶之中。在结构解析之余，我们还成功地鉴定了一种“杂质"。当然，我相信大家并不喜欢这种发现，也许很多人会去做squeeze，但这里并不是squeeze的应用范围。晶体学大多无意去鉴定杂质。不过究竟发生了什么，依旧需要实验人员自己去排查自己的反应和其它测试表征的数据，比如通过HPLC和质谱分析中观察到相应的峰，亦或是核磁中观察到相应的信号。简单的取代基上的差异，看起来还算是比较清晰。对于一些结构类似的分子混在一起的结晶，可能会让结构精修看起来非常的费解，比如在同样的位置有两种基团。然而在数据没有问题的情况下，电子云总归会有一个合理的解释。这时候一些看起来不起眼的线索，可能就会是破译问题的关键。尤其是自己做化学合成的线索。所以每个人其实都应该自己参与到结构解析的过程中，而不是当甩手掌柜。如同hkl文件一样，晶体本身是结果，过程只有每个人实验人员自己知道。失去了一些关键信息，结构解析可能会走向歧途。比如下面这个结构，开始的时候我们会觉得异常的奇怪。初始的结构和预期结构一致，但是结构中的某个苯环的三个原子温度因子特别的大。其中C3原子的上下各有一个非常大的Q峰。看起来像是C3原子的无序。但是这里如果是苯环，C3原子无论如何也无法运动到这么两个位置。那么这里会是什么？

▲图 3 abnormal Q peak 

那么我们来做些假设，C3 C4 C5 过大的温度因子，实际上并不是无序，而是占有率的问题。也就是这三个原子在这里只有部分占据，表示着，在一些晶胞中的分子中，这三个原子是不存在的，可能只有50%左右。而Q1和Q2 距离C2的距离大约在1.7Å左右。看起来像是C-Cl原子的键长。但是Q1和Q2的间距只有2.56A，看起来特别像是1，3碳原子之间的间距。所以假设这是另外一种分子，可以有不同的可能性，比如两边都是Cl，两边都是C，或者是一边是Cl的上下无序。缺少了合成和其它辅助的信息，所有的猜测只能基于结构和电子云的逻辑去尝试。尝试下来较合理的结果，是下图中两种分子的混合，而且比例接近50%。所以可想而知原料中掺杂了多少“杂质"，或者说这是混合物已经不能称之为杂质了。

▲图 4  混合的分子结构

我不知道在原料提纯后，这样刚性的分子位置再出现类似的情况下，还会剩下多大的可能性。但如果不是有意如此，尽量纯的原料应该会帮助我们避免一些无意去做的“新发现"。而这些看似诡异的Q峰，已经不是单纯的结构解析的问题。